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稀释平板法

数换算成单位重量(体积)样品中微生物的数量。操作程序①制备悬浊液,称取10克待测样品放入盛有100毫升无菌水的三角瓶中,充分振荡,使微生物与基质分开并均匀分散在无菌水中成为悬浊液;②制备稀释液,将该悬液依次按10倍法稀释至所需稀释度。

系列稀释后的待测样品培养在琼脂平板上出现菌落数的计量方法。是测定活的微生物数量的经典方法之一,可用于分析土壤、水样、乳类、食品及其他材料中细菌、芽孢杆菌、真菌和放线菌等的数量。最适用于菌体大小和重量都差不多的类群,如细菌和酵母;并可用于分离纯培养物。

方法原理

设想当已知重量(体积)的样品在适量的溶液中振荡时,微生物能与基质分开,这些分开了的微生物细胞在营养琼脂平板上生长成分散的单个菌落,再根据菌落数换算成单位重量(体积)样品中微生物的数量。

操作程序

①制备悬浊液,称取10克待测样品放入盛有100毫升无菌水的三角瓶中,充分振荡,使微生物与基质分开并均匀分散在无菌水中成为悬浊液;②制备稀释液,将该悬液依次按10倍法稀释至所需稀释度。稀释过程中,所用吸管在每次吸取悬液时,需在稀释液中反复吸入吹出悬液3~5次,使管壁吸附部分饱和,以减少因管壁吸附而造成的误差,并使悬液进一步分散均匀;③接种琼脂平板,根据各类微生物在样品中的数量多少,选择经过适当稀释的稀释液,将其定量(混菌法1毫升,刮刀法1/20毫升)接种于盛有营养琼脂培养基的培养皿中。注意用同一支吸管接种同一样品不同稀释度的悬液于培养皿时,应从高稀释度开始,然后依次接种较低稀释度的悬液,再用混菌法或刮刀法使悬液扩散均匀;④培养与计数,将皿倒置于28~30℃恒温下培养一定时间,细菌计数培养3~5天,放线菌10~14天,均选取出现菌落数在20~200之间的培养皿;有菌培养5~7天,选取菌落数在10~100之间的培养皿,记取皿中菌落数。

若进行芽孢杆菌测数,需选取适当稀释度的悬浊液于75~80℃水浴中煮15分钟,然后再按前述程序接种该悬液于琼脂平板,用刮刀法涂抹均匀、培养和计数。

计算方法

混菌法接种的计算法

稀释平板法

刮刀法接种的计算法

稀释平板法

由于培养基和培养条件有较高的选择性,以致相当部分的微生物不能正常发育成菌落,其原因有多种:①样品中的菌聚集成团或吸附在土粒上未被分散,以致平板上形成的菌落数低于实际菌数;②由于有的孢子在稀释的条件下不能发芽,无法形成肉眼可见的菌落;③由于放线菌、真菌的菌丝、孢子和其他孢子器的大小、重量相差悬殊,用此法所得菌落多数从孢子发育而来,而且难与由菌丝发育而成的菌落相区分。故应用此法时,样品最好多次重复,并宜用生物统计法评价分析结果。