与生物氧化作用偶联的腺苷二磷酸（ADP）磷酸化过程。即底物的电子通过呼吸电子链传递至氧的过程中，产生能量驱动ADP与无机磷酸（Pi）合成腺苷三磷酸（ATP）。一分子还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化生成3分子ATP，而一分子还原态黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH₂）的氧化生成2分子ATP。氧化磷酸化活性的指标为P/O或ADP/O，即氧化磷酸化作用形成ATP所消耗的Pi或ADP的分子数与呼吸吸收的氧原子数之比。

氧化磷酸化作用的机理，亦即电子流的能转变为ATP的化学能的能量转换机理，至今尚无定论。目前存在三种学说：①化学偶联假说。假定在电子传递过程中先形成一种高能的中间化合物，然后通过这种高能中间化合物形成ATP。但至今尚未从线粒体中分离出这种高能中间化合物。②构象偶联假说。认为电子传递所释放出的能量贮存在由电子流造成的一种蛋白质构象变化中，然后在回复原来构象时释出能量，用于ADP的磷酸化。近年来博耶和斯莱特（Boyer&Slater）提出了构象学说新模式，认为在电子传递过程中首先使线粒体内膜呈贮能态，进而促进ATP酶变构，在一个活性中心上让ADP与Pi紧密结合，而在另一个活性中心上使ATP结合松弛。能量供应并非用于使ADP与Pi缩合，而仅是使第一个活性中心对ADP与Pi的亲和力增强，使其易于合成ATP，同时第二个活性中心上的ATP亲和力减弱而易于释出。如此酶的活性中心交换接受能量，交换变构，交换合成和释出ATP，以完成氧化磷酸化过程。但质子如何使线粒体内膜呈贮能态，又如何使ATP酶变构，其机理尚未获说明。③化学渗透学说。这个学说是米切尔（P.Mit-chell）1966年提出的。他认为呼吸链上电子的传递驱动质子越过线粒体内膜，质子的单向流动使膜的两侧形成一个质子浓度梯度，这种膜内外的化学势差产生一种电势差，可以推动内膜嵴上的ATP酶合成ATP。化学渗透学说得到许多实验的支持，如在呼吸电子链运转时质子梯度的形成，即线粒体膜外侧pH值的下降已为试验所证实。按照化学渗透学说，即使没有呼吸电子链的运转，其他原因造成的质子梯度亦能促使ATP合成。这个学说也能阐明光合磷酸化作用。某些解偶联剂的作用亦可用化学渗透学说来解释，如2，4-二硝基酚能使质子自由透过线粒体内膜，破坏了质子梯度的建立，ATP当然就不能合成。质子的单向转移是化学渗透学说的基础，质子转移与呼吸链运转偶联的机制至今尚不清楚。在这个问题上，可能还要借助于构象偶联假说的一些理论。