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组培脱毒技术

用组织培养技术,从带毒植物的茎尖、芽等组织获得无毒再生植株的方法。在脱毒过程中主要选用茎尖、芽等生长点作为外植体(explant),故又称为茎尖脱毒(virus-free meristem culture)。组培脱毒是在组培培养学和病毒学相结合的基础上发展的技术。简史1922年美国罗宾斯(J.A.Robins)等用豌豆、玉米和棉花根尖进行组织培养首次获得完整植株。

用组织培养技术,从带毒植物的茎尖、芽等组织获得无毒再生植株的方法。在脱毒过程中主要选用茎尖、芽等生长点作为外植体(explant),故又称为茎尖脱毒(virus-free meristem culture)。组培脱毒是在组培培养学和病毒学相结合的基础上发展的技术。

简史

1922年美国罗宾斯(J.A.Robins)等用豌豆、玉米和棉花根尖进行组织培养首次获得完整植株。1943年美国怀特(P.R.White)发现在感染烟草花叶病毒植株生长点附近病毒的浓度很低,甚至没有病毒。1952年摩瑞尔(G.M.Morel)等用感病的大丽菊茎尖分生组织,第一次培养得到脱毒的大丽菊,标志着组培脱毒研究工作的开始。以后相继进行了马铃薯、菊花、兰花、百合、草莓、矮牵牛、鸢尾等茎尖脱毒的研究,并获得成功。中国最早的组培工作是李继侗等1933年用银杏胚培养成植株。其后,罗宗洛、崔澂、罗士韦等在玉米、烟草等作物上进行了幼胚、根尖和茎尖组织的培养。吉林农业大学等单位率先开展了茎尖脱毒工作,1976年中科院等单位用茎尖脱毒技术获得了无毒马铃薯。目前已得到了菊花、大蒜、百合、石竹等植物的无毒植株(种球)。利用茎尖脱毒技术获得无毒种球(苗),已成为防治病毒病的一项有效途径。

组培脱毒法和程序

即茎尖脱毒法。主要是茎尖的选取和消毒、培养基制备等。

茎尖的选取和消毒

一般选用茎尖和芽,若为休眠鳞茎、球茎需先进行低温处理待发芽后再取材。材料用75%酒精表面消毒,再用0.1%升汞溶液消毒,经无菌水冲洗2~3次置于解剖镜下切取茎尖0.1~1.0毫米的切段,移植到愈伤组织培养基上培养,所有操作均在无菌条件下进行。

培养基的制备

用于组织培养的培养基有30种以上,但都是在费佛培养基的基本配方上加以改进,并加入一些活性物质发展而来的。目前应用的大多数培养基是为培养愈伤组织设计的,所以对茎尖培养并不完全适合。摩瑞尔农事培养基等适用于生长点培养,其主要成分为硝酸钙(Ca(NO32)、硝酸钾(KNO3)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸亚铁(FeSO4)、肌醇、生物素等,可用于大丽菊、菊花、百合等茎尖脱毒培养。大量的研究结果表明:培养基附加2,4-D、激动素(KT)可有效地使许多外植体产生愈伤组织;当提供1毫克/升激动素(KT)和0.3毫克/升吲哚乙酸(IAA)时,能用于草本植物的茎尖培养,建立脱毒植株繁殖系。一般激动素/生长素的比例大,有利于芽的发生;生长素/激动素比例大,则有利于根的发生。

组培的条件

要求光照强度在1500~2000勒克斯,每日光照10~12小时,温度为22~25℃。

脱毒效果的鉴定

主要有鉴定植物法和抗血清鉴定法。

植物鉴定法

利用病毒在指示植物上产生的特有症状来鉴定病毒,一般采用枯斑反应寄主。

抗血清鉴定法

常用的是琼脂双扩散法和免疫电镜法。琼脂双扩散法测定过程是先将热溶的精制琼脂溶液倒入培养皿中,待冷却形成一层凝胶后在胶上打孔,孔的直径为0.3~0.4厘米,两孔间距约0.5厘米,然后将样品(抗原)和抗血清(抗体)加入不同位置的孔中进行扩散,观察有无沉淀带。免疫电镜法根据抗体和抗原在铜网上的结合方式又分为两类:聚焦法是在铜网上先加抗血清,固定1小时后再加待测样品,用磷酸缓冲液冲洗并负染待干燥后观察。修饰法是先加病毒样品,再加抗体,负染观察。另一种血清检验方法是斑点免疫结合测定法,此法是对酶联免疫吸附法(ELISA)的改进,使之更为方便、实用。具体方法是用华特曼1号滤纸打成直径为7毫米的圆片来代替微量固定反应板,将测样分次滴在小片上并使之干燥后,放入直径为10~15毫米的圆筒状小瓶中加入抗血清,在旋转振荡器上摇动0.5~1小时。然后用TBS洗涤。再加入A蛋白—过氧化物酶于小瓶中,连同纸片一块摇动15~30分钟,再洗涤。最后加入底物——氯萘酚并摇动10分钟即可。如果是正反应,在滤纸片中央呈现深蓝色,负反应仅呈现均匀的淡蓝色。

经鉴定获得无毒植株后需要复壮培养和快速繁殖再进入推广应用。在生产环节中应尽量避免病毒的再度感染,有个别植株感病时应及时拔除。