用富集¹⁵N的N₂、无机或有机肥料为示踪剂或利用¹⁵N天然丰度的变异，根据固氮体对¹⁵N的吸收，测定生物N₂固定的方法。同位素法的最大优点是能区分固氮植物来自土壤、肥料和大气的氮，是唯一能直接测定生物固氮量的方法。比凯氏定氮法准确、灵敏，能克服乙炔还原法的不足，还能在田间条件下测定固氮作物的实际固氮力。¹⁵N测定生物固氮有下列四种方法。

利用固氮微生物对N₂的还原作用，将固氮体系直接暴露在含有¹⁵N₂的密封气相系统一段时间，然后取样分析。如果发现固氮体系有¹⁵NH₃或其他¹⁵N^-富集的衍生物，即证明有固氮作用发生。由下列公式计算固定的氮量：

15N测定生物固氮

式中 TN为固氮体总氮量，A%E（F）和A%E（A）分别为固氮体和标记氮气的¹⁵N原子百分超。该法已用来提供N₂固定最直接的证据，确定C₂H₂/N₂б，以校正乙炔还原法中由产生的乙炔计算的固定N₂量。由于作物在密闭的生长室中不同于田间条件，而且只能保持一个短时间，所以很少应用此法来测定固氮作物的实际固氮量。但此法适用于测定水稻土的非共生固氮。

通过比较生长在相同¹⁵N/¹⁴N比的土壤中的固氮作物和作为对照的非固氮作物的¹⁵N富集度，测定固氮作物的固氮力。施用¹⁵N标记的无机或有机肥料，使土壤获得标记，生长在该土壤中固氮作物和适宜的非固氮作物（对照作物）从土壤中吸收相同¹⁵N/¹⁴N比的氮，而固氮作物还从大气中吸收氮。结果其体内的¹⁵N丰度由于被来自大气中的¹⁴N所稀释而低于对照作物。按下列同位素稀释公式计算豆科作物中来自大气氮的百分率，即固氮率（Ndfa）：

15N测定生物固氮

式中 A%E（F）和A%E（NF）分别为固氮作物和非固氮作物的¹⁵N原子百分超。同位素稀释法可用于田间固氮作物的原位测定，б较接近自然。是一种间接的，能准确测定一个长时期内固定的氮量的方法。所用¹⁵N丰度要求不高，测定费用低。因此得到广泛应用。但依赖于适宜参考作物的选择。