为评价化学物的安全性进行的毒性试验。安全试验设计的内容包括：①试验动物的选择。选择相应的试验动物，使受试物在其体内的代谢过程与最终应用或接触受试物的人或家畜的相同。最常用的试验动物有小鼠、大鼠、兔和犬等。试验过程可采用2～3种动物同时进行，其中一种为非啮齿类动物如犬、猴等。试验设计时，可根据受试物的性质选择不同种类的动物。一般选用成年动物，雌雄各半。试验动物的年龄一般按体重计算。试验动物的健康和营养状况必须良好，饲养管理条件要能保证动物的正常生长、发育和维持健康。②试验动物的分组。根据试验目的和任务确定分组数。按随机原则将动物编入各组。除试验组外，需设立对照组（平行或自身对照）。如果组内试验动物的数量设计不周密，在试验结束时，往往会感到组内试验动物的数量不足。组内动物数量的减少会影响对轻微毒性反应观察的可靠性。如需定期进行病理剖检，应在开始试验时增加试验动物的数量，到试验结束时至少每组仍有雌雄动物各10只。③受试物。化学上应尽可能纯净，并能代表今后推广的商品。溶媒或赋形剂必须是惰性的。④接毒途径、频率和剂量。一般毒理试验最常用的接毒途径是口服，试验采用的接毒途径应与实际接毒途径一致。试验期间应连续给药，不能间隔。接毒开始后应每天进行观察。在进行亚慢性、慢性及某些特殊毒性试验时，受试物的剂量应选择适当，即高剂量要能引起明显的临床中毒；中等剂量能导致适度中毒；低剂量应为不引起中毒的最高剂量。⑤观察指标。一般应包括中毒症状、死亡率、死亡时间、采食量、饮水量、体重、体温、呼吸、脉搏、病理症状、各种生物化学和血液学指标。⑥试验结果的统计处理。计数资料通常用X²检验，计量资料通常用t检验或方差分析。

安全试验分为两大类：①一般毒性试验。包括急性、蓄积毒性及耐受性、亚慢性和慢性毒性试验。②特殊毒性试验。包括繁殖、致畸、致癌、致突变试验，还有局部刺激、溶血、行为和迟发性神经毒性试验等。

观察一次或在24小时内多次给予受试物后动物所产生的毒性反应。目的是确定受试物的毒性，初步了解敏感动物及毒作用的靶器官，为亚慢性和慢性毒性的试验设计提供资料。

试验时可经口、皮肤、吸入或注射等方法给予受试物，内服是最常用的接毒途径。接毒后一般观察7天（1～28天），若观察期临近结束而动物尚未死亡，则应延长观察时间。试验期间观察试验动物对受试物的毒性反应，包括毒性症状及其出现的时间、动物死亡数和死亡时间、中毒或致死量。一般用LD₅₀（见半数致死量）作为表示毒性的参数。

急性毒性试验常选用两种性别的小鼠和（或）大鼠，选用试验动物的体重为：小鼠18～24克；大鼠180～240克；豚鼠200～250克；家兔1500～2000克。对一种受试物的毒性，若已有一定的了解，则应选择敏感动物进行试验。

观察多次给予小剂量的受试物后，试验动物所产生的毒性反应。这是一种估计毒物在体内的蓄积量和蓄积作用以及动物对毒物耐受性的方法。

蓄积毒性作用

对试验动物多次给予小剂量的受试物，当给予受试物的时间间隔和剂量超过机体解毒和排毒能力时，可导致受试物在体内蓄积，并由此引起的毒性作用。毒物在体内蓄积的量与单位时间内吸收和消除量有关。

耐受性

试验动物在多次接受受试物后，可能对受试物的毒性反应逐渐减轻，甚至不出现毒性症状。这是由于机体对该受试物毒性作用的敏感性降低所致。

本试验的目的是了解受试物在动物体内的蓄积情况以及动物对受试物是否会产生耐受现象。研究蓄积毒性的方法较多，蓄积毒性试验结果的评定标准也不统一。

固定剂量连续染毒法

一般多以小鼠（或大鼠）作为试验动物，常以死亡作为观察指标。在正式试验前，首先测定小鼠经口LD₅₀，然后将试验小鼠分成2～4个组（每组10～20只动物），每天固定用1/2～1/20LD₅₀的剂量给各组小鼠连续染毒，直至试验组动物发生半数死亡。如果分次染毒累积剂量已达5个LD₅₀，而小鼠仍未达到半数死亡，亦可结束试验。

剂量定期递增染毒法

取小鼠或大鼠30只，每天染毒，以4天为一期。染毒剂量每期递增一级，以0.1LD₅₀作为开始量，以后按等比级数1.5倍逐期递增（表1）。一般连续染毒20天，如死亡动物未达半数，亦可结束实验，因此时分次染毒总剂量已达一次染毒LD₅₀的5.3倍。

上述方法的试验结果均以蓄积系数进行评价。

化学物安全试验

式中 K为蓄积系数，LD_50（n）为分次染毒引起动物半数死亡的累积剂量，LD_50（1）为一次染毒引起动物半数死亡的剂量。蓄积作用的评价标准见表2。

表1 剂量定期递增染毒法染毒剂量用表

表2 蓄积作用的评价标准

将蓄积毒性试验结束时存活的小鼠，再给1个LD₅₀的剂量，在观察7天后统计动物的死亡率，并与预先未经毒物处理的对照组的死亡率比较。若试验组动物的死亡率明显低于对照组，表示动物产生一定的耐受性；若试验组动物的死亡率高于对照组或无显著差别，则表示无耐受性。

观察在多次给予受试物后，试验动物所产生的毒性反应，其试验期通常为30～90天，有时仅为14天。

本试验的目的是进一步了解受试物有无蓄积作用；试验动物能否产生耐受性；测定受试物的靶器官和靶组织；初步估计不出现毒性作用的最大耐受量（即最大无作用剂量）和出现毒性作用的最小剂量（最小作用剂量）。确定是否需要进行慢性毒性试验，并为慢性毒性试验剂量的选择提供依据。

本试验常以大鼠和犬作为试验动物，一般均用断乳动物，如大鼠在出生后3～4周（体重40～60克）开始试验。选用的试验动物不应少于两种，一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物，雌雄各半，前者每组30～40只，后者6～10只，一般采用饲喂法给予受试物。

一般试验组应用3种剂量（LD₅₀的1/10～1/80），其中1～2组无反应，而另一些组的动物能表现毒性反应，但不应引起死亡。对照组有时需设两个，即基础饲料对照组和配制饲料对照组。

观察指标主要有：采食量、摄水量、一般健康状况、生长（每周称重一次）、死亡、行为和临诊症状，还有血尿生化指标的检验、器官功能（如肝功能和肾功能）的测定和器官的相对重量（如肝体比、肾体比）、病理组织学检查等。

观察在长期给予受试物后，试验动物所产生的反应。给予受试物的天数超过90天，一般小鼠的试验期为4～5个月，大鼠和家兔为12个月。

本试验的目的是了解试验动物长期连续摄入受试物对机体的影响，确定最大无作用剂量，为制定人体每日允许摄入量（ADI）提供依据。通过慢性毒性试验，可了解短期毒性试验所不能测得的反应。

慢性毒性试验至少应用一种啮齿类动物（一般用大鼠）和一种非啮齿类动物。一般也应用3～4种剂量（LD₅₀的1/10、1/50、1/100和1/1000），并设对照组。组内试验动物数与亚慢性毒性试验相似，观察指标亦与之相似。

目前大多数学者认为，可按以下公式，即慢性毒性试验的最大无作用剂量＝亚慢性毒性试验测得的最大无作用剂量÷20以亚慢性毒性试验结果推测化学物的慢性毒性。这样可节省试验经费和缩短试验期限，减少外界因素的影响，从而可促进各种新的化学物的开发。

繁殖试验

检验受试物对试验动物生殖机能影响的一种方法。

本试验旨在了解受试物对试验动物生殖机能的影响以及对胚胎的毒性，为致畸试验提供资料。

目前，繁殖试验应用最多的试验动物是大鼠，也可用小鼠和家免。大、小鼠每组雌20只，雄10只，家兔雌雄各12只。观察代数随观察目的不同而异，可作一代、两代、三代或多代观察。若检查不是动物经常摄食或接触的受试物，欲了解其能否影响动物的发育和生长、妊娠、分娩和泌乳等，可进行一代繁殖试验（single-generation reproduction study）。若检查动物经常摄食或摄食量较大的受试物，则需进行多代繁殖试验（multigeneration reproduction study）。

可在90天亚慢性毒性试验结束后，用同一批动物继续进行繁殖试验。一般将受试物拌入饲料或加入饮水中，亲代和仔代均接受相同的饮水和饲料。在整个试验期间，各试验组动物不论亲代或子代均摄食含受试物的饲料，对照组则摄食未加入受试物的对照饲料。为避免受试物对母体引起直接的毒害作用，受试物的剂量不宜太大。低剂量组一般可按最大无作用剂量的1/30给予受试物；高剂量组可按最大无作用剂量给予，或给予有轻度中毒表现（如体重下降或进食量减少）的剂量。必要时再设一个中等剂量组。

除一般健康状况、体重、进食量、饮水量和死亡情况外，着重观察受孕率、妊娠率、出生存活率、哺育成活率、产仔总数、窝重和平均仔重等与生殖机能有关的各种指标。

致畸试验

检验受试物是否具有引起胚胎畸变现象的试验方法。

本试验旨在了解受试物是否通过母体对胚胎发育过程（主要是胚胎的器官分化过程）产生不利影响。

本试验通过在胚胎细胞分化和胎儿组织形成期给受孕动物饲喂受试物，然后在分娩期观察仔胎是否出现畸形来判定受试物的毒性。

试验动物常用小鼠、大鼠和兔。至少应用三种剂量。一般以最大无作用剂量用于最高剂量组，以其1/30左右的剂量用于低剂量组。一般小鼠和大鼠于妊娠6～15天，兔于妊娠6～18天饲喂受试物。在妊娠结束前1～2天，以手术方法从母体内取出胎儿，检查每个活胎有无外观畸形，并进行特殊的固定或染色以检查胎儿内脏、脑部及骨骼畸形等。根据各组动物畸胎出现的数量及所产活胎的总数，计算畸胎发生率。经统计处理后求出最小致畸剂量，并以致畸指数比较毒物的致畸强度。致畸指数＝，其中A为母体的LD₅₀，B为最小致畸剂量。致畸指数在10以下者为非致畸物；10～100者为致畸物；＞100者为强致畸物。

致突变试验

检验染色体畸变和基因突变的试验方法。染色体畸变是指染色体的形态结构或数量发生变化，可通过光学显微镜直接观察。基因突变则不能用显微镜直接观察，而需运用特殊方法进行检验。

本试验旨在检验受试物是否具致突变作用。致突变试验的方法可归纳为两大类：①检验染色体畸变的试验方法。②检验基因突变的试验方法。

染色体（畸变）分析法

通过对细胞染色体的数量及有无断裂、缺失、互换和裂隙等畸变指标的分析，检验受试物可能引起的细胞遗传的异常现象。根据出现畸变染色体的总数，算出畸变率，在对照组与试验组中进行分析比较。由于生殖细胞和体细胞都可发生染色体畸变，常见的染色体分析法有睾丸精原细胞染色体分析法、骨髓细胞染色体分析法、外周血细胞体外培养染色体分析法和骨髓细胞微核检查法。

显性致死突变试验法

通过观察胚胎发育状况及死亡率来检验致突变物引起的哺乳动物雄性生殖细胞的突变。

本试验多用小鼠或大鼠，也可用家兔或其他动物。对照和试验雄鼠与未给受试物的雌鼠交配。试验雄鼠可一次或于短期内（如5～7天）多次给予受试物。在停给受试物后，与性成熟的雌性动物同笼（每笼放雄鼠1只，雌鼠2～3只）交配一周，一周后另换一批雌鼠再行交配，连续交配8～10批。在交配期，雌雄动物均饲以基础饲料。在妊娠结束前（如小鼠在交配后14天），将雌鼠处死，剖腹取出子宫，并记录黄体数、着床总数、活胎数、死胎数（分别记录早期死亡胚胎和晚期死亡胚胎数）。根据受试物对各批胎儿的致死率，可确定精子发生周期中对受试物敏感的阶段。

常用致突变指数来表示受试物致突变性的强弱。

化学物安全试验

致突变指数越高，致突变作用越强。试验组和对照组在分别计算致突变指数后进行比较。

通过观察注入宿主动物体内的微生物的变化来检验受试物是否引起基因突变。

把指示微生物和受试物同时引到宿主动物体内，如受试物或其代谢物可引起试验动物突变，就会使接种在其体内的指示微生物同时发生突变。因而可将指示微生物在宿主体内培养一定时间，再从机体分离出来并测定是否发生突变。一般多以小鼠作为宿主动物，也可用大鼠或其他动物。指示微生物可用鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌等对哺乳动物致病力较弱的菌株。受试物可与指示微生物同时分别注入动物腹腔，也可经肌内注射同时给予，或者在接种指示微生物前1～2小时经口给予。在给予受试物后0.5～4小时内分别将动物处死，在无菌操作条件下剖开腹腔，用生理盐水冲洗。腹腔冲洗液用于测定细菌总数和发生突变的细菌数，算出突变频率。

化学物安全试验

突变频率越高，其致突变性也越强。将试验组与对照组进行比较，可确定受试物的致突变性。

通过体外观察微生物的生长情况来检验受试物是否引起基因突变。

本试验的基本原理是：组氨酸缺陷型（即突变型）的鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培养，则可使突变型产生回复突变，成为野生型，即恢复合成组氨酸的能力，因而能在缺乏组氨酸的培养基上生长，根据其生长菌落的数量判断受试物是否具有致突变性。若受试物可能经体内酶系统活化代谢后才具致突性，则可在培养基上同时加入哺乳动物的肝微粒体酶，使受试物活化而呈现致突变作用。

艾姆斯测定了300多种化学物，其中90%的致癌物同时具有致突变性，说明化学物的体外致突变性与体内的致癌性之间具有高度的相关性。

检验受试物及其代谢产物是否具有致癌作用或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验。

选择试验动物应根据动物对某种受试物致癌作用反应的敏感性而定。大鼠或小鼠对多种致癌物的反应较敏感，故致癌试验一般多选用大鼠或小鼠，有时还需增加一种非啮齿类动物如犬和猴。根据试验要求，也可选用其他动物。试验动物的数量不宜太少，一般啮齿类动物每个剂量组中雌、雄至少各25～50只，犬、猴每组4～6只。

试验期限通常要求从断乳开始（有时在断乳前开始）直到自然死亡，几乎包括整个生命期。小鼠试验期至少为一年半，大鼠至少为两年。若试验已进行一年半或两年，出现肿瘤的情况仍不甚显著时，则应继续延长。一般在动物接近自然死亡期前即进行病理剖检，以免因自然死亡而影响病变的观察。

试验过程中要求经常观察动物的一般状况，定期检查和记录肿瘤的总发生率、各种肿瘤的发生率和肿瘤出现期限等指标。病理学检查是评定受试物致癌作用的主要依据，在病理剖检时应仔细检查每一个器官，发现肿瘤或疑似肿瘤的组织器官均应进行细胞病理学检查。小动物的脏器较小，应作系统的组织学检查。

在对照组与试验组之间进行比较：①在对照组中出现的某种肿瘤，在试验组中的发生率是否增高；②在试验组中是否出现某种在对照组中从未见到的肿瘤。