用化学和物理学方法对组织和细胞的某些特殊物质、反应基团和酶促活性等进行定性、定位和定量研究的技术。目前组织化学方法除传统的显微组织化学法外，还包括电镜组织化学法、免疫组织化学法、放射自显影术、荧光分析法、组织吸收光谱法、组织X-射线分析法、显微烧灰法等。因此，组织化学是组织学与生物化学，分析化学和生物物理学等学科之间的边缘科学。运用组织化学技术、不仅能探讨组织和细胞以及一些更为细微的结构，在不同机能状态下的变化，借以揭露它们的本质，阐明它们在正常生理活动中所起的作用，还能检测它们在病理过程中的变化，为揭示疾病的机制提供线索，并为某些病理诊断提供依据。细胞化学主要是用细胞光度计进行测量，经显微解剖或以离心技术分离细胞各组分后进行的组织化学反应，以及在超微结构水平所进行的定性、定位研究。其方法与组织化学无根本区别。

用作用液处理组织切片，使组织或细胞内某种成分的整个分子或部分基团发生化学反应，在原位产生不溶性的有色沉淀物质，以便在光镜下据以鉴别该成分的化学性质和分布位置，并根据沉淀物颜色的深浅，估计其含量多少，故亦称呈色反应或组织化学染色方法。电镜组织化学法也是根据化学原理设计而成，但所要求的化学反应最终产物不是“呈色”，而是能吸收电子，从而得以在荧光屏上显示所检测的物质是否存在及其所在位置。

基本原则与要求

显微组织化学反应是在组织切片上进行的，除对组织切片制备的各个环节有严格的要求外，还必须：①反应必须具有高度的特异性或专一性；②反应产物必须是不溶性的，而且必须有色、始终沉淀在原位；③必须设对照试验；④反应必须迅速，且应有一定的灵敏度和可重复性。

对照试验

阳性对照比较简单，只需将已知为阳性的组织切片和被检测的组织切片一起进行反应，如前者仍呈阳性、即足以证明方法可靠。阴性对照亦称空白实验、主要是设法使组织切片中被检测物质的整个分子丢失；或释放不出游离的反应基团；或使其反应基团被遮蔽；或省略反应过程中某一关键性步骤；或省略作用液中某种重要药品等。总之，使反应不能正常进行而呈现阴性，并借此印证实验组的阳性结果确实表明组织切片中存在被检测物质。因此，在设计显微组织化学实验时，如预期为阳性反应，必须设阴性对照，以排除假阳性；如预期为阴性反应，必须设阳性对照，以证实反应过程中无差错；而情况不明时则必须同时设阴性与阳性对照，以便对反应结果进行分析。

组织切片的制备

石蜡法

与常规石蜡组织切片法基本相同（见生物制片技术）。

冰冻法

适用于脂类和大部分酶类组织化学反应。包括CO₂冰冻切片法、半导体致冷切片法和低温恒冷切片法。可用新鲜组织，也可用经过固定的组织。为了防止水解酶和其他物质移位和弥散，通常用4℃甲醛钙进行固定，不宜用含有汞，重铬酸盐或酒精的固定液，以避免组织变脆而不易切削。但是无论如何，经过固定的比新鲜组织的冰冻切片容易掉片，可事先用2%明胶甲醛液处理载玻片加以补救（见生物制片技术）。

冷冻干燥法

简称冻干法。先将组织块放在非常低温条件下超速冷冻（骤冷），再在低温真空环境中，使细胞内外的水分升华而达到干燥状态（干燥），随即直接进行透蜡、包埋和切片。所谓非常低温是指在-70°～-273℃范围内，常用冷冻剂为液氮（-196℃），还可用酒精加干冰（-79～-125℃）、液态空气（-195℃）和液氦（-272℃）；而超速冷冻是指在2秒或更短的时间内达到冷冻状态。在骤冷前可先将组织块浸入防止发生冻裂的保护剂，如30%甘油或20%二甲亚砜等溶液中10～30分钟；还可用冰点低，沸点高的液体如异戊烷（-165℃）、氟里昂（-158℃）或丙烷（-185℃）作为中间冷煤剂，以避免因冷冻剂如液氮等快速蒸发而在组织块周围产生气泡、使温度传导速度缓慢，以致不能达到骤冷目的。干燥过程中要求的低温条件一般在-30～-40℃，有人认为采用-60℃可以避免组织发生再结晶。干燥过程可在专用的低温干燥器中进行，干燥的组织块回升到室温后即可进行透蜡、包埋和切片。贴片不能采用漂浮水捞法，须直接在涂有蛋白甘油的载玻片上加温舖开、或轻轻加压使其贴牢，然后用甲醛、戊二醇或锇酸蒸气固定。

冷冻替代法

使组织块在低温（0～-70℃）条件下，快速冷冻，再用液体脱水剂（称替代液，常兼具有固定作用）取代组织中水分，然后将组织块置于室温、30分钟后即可按常规进行包埋。冷冻替代法在保持组织和细胞的原有形态结构、化学组成及其分布位置方面仅次于冷冻干燥法，具有可重复性，且无须贵重仪器设备，经济方便，普通实验室均可进行。一般显示氧化酶、水解酶、水溶性同位素和其他化学物质均可取得良好效果。

核酸显示法

孚尔根反应

针对五碳糖设计而成的鉴别DNA常用方法。主要是用弱酸（1NHCl））处理组织切片，使细胞内DNA水解，嘌呤从糖甙键上移去而脱氧核糖的醛基暴露，再用雪夫氏试剂与醛基作用，生成紫红色沉淀，即证实有DNA存在。弱酸处理组织切片延续的时间与固定剂的种类、固定时温度的高低和时间的长短有关，过度水解会使核酸解聚，反而导致反应减弱，甚至成为阴性。由于细胞内的多糖和含醛脂类也能使无色品红重现红色，因此，在进行孚尔根反应时必须设置省略水解步骤的对照，以排除假阳性，如同时安排DNA酶提取试验作为对照，则可进一步加强孚尔根反应的特异性。对RNA进行孚尔根反应时呈现阴性的机制尚不清楚，可能是核糖的氧原子使嘌呤不易脱落的缘故。此外，孚尔根反应结合显微分光光度测量技术可对细胞内DNA进行定量分析。

甲基绿-派若宁反应

DNA与RNA的磷酸基使两者均易与碱性染料结合。甲基绿和派若宁均为碱性染料，但在适宜条件下，甲基绿对高聚的DNA有特异亲和性，派若宁则可使RNA着色，只是特异性较差。因此，将DH4.8左右的甲基绿和派若宁混合液处理组织切片（以卡罗氏或辛克氏固定液效果较好），可使DNA和RNA分别被染成绿色和红色，其确切机理不明，仅知甲基绿对DNA的结合能力与DNA分子双螺旋空间构型的完整性有关。如用1%NaCl或核糖核酸酶提取RNA，然后进行甲基绿-派若宁反应，而结果派若宁着不上色，即可证实细胞内存在RNA。

紫外线显微分光光度检测法

核酸含氮碱基（嘌呤和嘧啶）在紫外光260nm波段内有发生自然吸收的特性，所以利用紫外线分光显微镜可以检测细胞内是否存在核酸，并可测定其相对含量，但不能区分DNA和RNA。

糖类显示法

许多糖类由于溶解度大，反应性低，不适于进行组织化学研究，目前可用组化方法显示的糖类仅限于多糖、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白和糖脂等。糖类的保存应采取快速取材、低温固定，固定剂以中性福尔马林和卡罗氏液为宜，用冷冻干燥法切片最为理想，低温恒冷切片可以避免产生极化现象。显示这类物质的方法，除传统的贝氏胭脂红染色法和碘反应外，广为使用者为过碘酸雪夫反应（PAS反应），还有爱尔森蓝显示酸性粘多糖法和甲苯胺蓝显示具异染性的酸性粘液物质法等。PAS阳性反应生成紫红色化合物。PAS阳性物质包括糖源、淀粉、纤维素、粘蛋白、糖蛋白、糖脂和部分粘多糖等，不饱和脂类和磷脂也呈PAS阳性反应，因此必须加以进一步鉴别。例如用淀粉酶透明质酸酶或纤维素酶等分别进行抽提试验，借以判断PAS阳性物质是否为糖原、透明质酸、果胶或纤维素，也可以用碘反应法勘定淀粉；氧化锌-碘法勘定纤维素；苏丹黑B染色法勘定糖脂和米伦反应勘定糖蛋白等。

蛋白质和氨基酸显示法

通常只能借测定氨基酸的种类和含量间接地探讨蛋白质的存在情况，此外，还可采用等电点测定法、溶解度测定法、蛋白质分解酶消化试验、抗原抗体反应等方法对蛋白质进行鉴定。蛋白质和氨基酸的显示方法中，常用快绿染色法区分碱性蛋白与酸性蛋白，肝素-爱尔森蓝染色法显示碱性蛋白，米伦反应检测苯酚以勘定酪氨酸、坂口反应检测胍基以勘定精氨酸、碱性四唑盐法检测硫氢基和二硫键以勘定胱氨酸和半胱氨酸、四氮偶联反应检测酚基、吲哚基和噻唑基以勘定酪氨酸、色氨酸和组氨酸等。

脂类显示法

由于脂类易溶于有机溶剂，故通常用冰冻法制备组织切片，只有用锇酸固定或用甲醛固定后再经过较长时间铬化，才能采用石蜡切片法。脂类显示法大多为物理方法：如用偏振光显微镜检测脂类的双折光或单折光性，用荧光显微镜检测脂类的自发性和继发性荧光均可区分某些脂类，但在应用上有一定的局限性；脂溶性染料如苏丹Ⅲ、Ⅳ、油红、尼罗蓝之所以能使脂类着色也是一种物理现象，因为它们并未与脂类发生化学反应，只是溶解于其中而使含有脂类的结构显现出一定的颜色。化学方法有利于锇酸被不饱和脂肪酸还原而呈现黑色的特性勘定某些脂类；用重铬酸盐氧化脂类，并与之紧密结合成为不溶性，同时重铬酸盐又起媒染剂作用，使其能被染料染色等。显示脂类的常用组织化学方法除用溴-苏丹黑法可显示任何脂类外，还有酸性氧化苏木精显示磷脂、硫酸-尼罗蓝法显示酸性及中性脂类、铜-红氨酸法显示游离脂肪酸、过氯酸-萘醌法显示胆固醇等。

酶类显示法

酶的保存及影响酶活性的因素

制备用于酶类组织化学的切片比一般组化反应要求更为严格。因为酶极易失活，而在保存酶活性和保存组织形态结构和酶分布位置之间往往存在矛盾。例如使用固定剂常可较为完整地保存组织的形态结构和酶的分布位置，但往往同时又会不同程度地使酶失活；而冰冻切片虽有利于保存酶活性，但组织的形态结构和酶的分布位置又常会遭到破坏。所以应根据所检测酶的种类采取不同的处理方法：如选用新鲜材料或固定后的材料：石蜡切片、冰冻切片或低温恒冷机切片，甚至冷冻替代法切片等。常用于酶类组化反应的固定剂为冷中性福尔马林、冷丙酮或冷酒精。

影响酶活性的因素很多，如酶反应温度过高酶易失活；过低则反应速度变慢，容易引起扩散，一般为37℃左右。酶反应也要求适宜的pH，大部分酶在pH7.0时反应速度最快，但碱性磷酸酶要求pH9.2，而酸性磷酸酶则要求pH5.0，此外，组织切片中的酶可被抑制剂破坏或阻抑，也可被激活剂所激活。

对照

酶通常为水溶性、较易扩散，加之酶类组织化学反应中显色物质的来源与一般组化反应不同，一般组化反应是组织和细胞内某种物质直接与试剂作用，就地生成反应产物而后显色；酶反应则作用于底物，由底物分解的产物与试剂作用而显色，即由来源于底物的显色物质间接地显示酶所在位置，在反应过程中，特别是在反应条件不适宜、反应速度缓慢的情况下，极易发生扩散或吸附而造成假阳性。另一方面，由于酶不易保存而又极易受多种因素影响，故即使反应呈阴性，往往还须排除可能出现的假阴性，所以对照试验绝不可省略。设置对照的方法有：①用沸水、强酸、强碱、氧化剂或金属处理组织切片，破坏酶的活性；②加入酶抑制剂；③作用液中不加底物；④安排阳性对照；⑤与其他研究方法的结果印证。

显示方法

最常用者有金属-金属盐法（金属沉着法），偶联偶氮色素法（偶氮色素法）和色素形成法等，其他还有色素底物法、底物标记法、底物薄膜法、底物荧光法和合成法等。此外，还可用偏光显微镜检测底物分解产物等方法。

金属-金属盐法是利用金、银、铜、铁、铅、钴等金属本身或其盐类和化合物大都具有颜色，而酶反应产物通常均可与其结合的特性；捕捉酶反应产物，使其与上述物质结合而显色，从而证明某种酶的存在及其分布位置。偶联偶氮色素法是使酶作用于底物，底物分解产物再与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素，从而显示酶的存在及其位置。色素形成法是使酶作用于底物产生的无色物质与作用液中的另一无色试剂结合，在局部位置形成有色物质，从而显示酶的存在及其位置。

利用抗原-抗体反应的专一性，辅以适当的化学方法，检测组织和细胞中抗原物质及其分布位置。诸如酶、多肽和除类固醇激素以外的其他激素均可用免疫组织化学方法进行检测。由于免疫组织化学是借助事先结合在抗体上的标记物质，在光镜或电镜下检测是否发生抗原-抗体反应和抗原的分布位置，所以必须用高纯度的抗原制备高质量的免疫血清，并选用适宜的标记物，使组织切片上最终反应产物是不溶性的有色沉淀，或者使超薄切片上标记物本身或其反应产物是电子致密度高的物质。常用标记物有荧光素、酶类蛋白质、金属蛋白质、金属以及金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素和抗生素类的大分子物质与酶或金属的复合物等。免疫组织化学方法可分为直接法、间接法以及各种标记物-抗体复合物法。

免疫荧光法

标记物为荧光素，如异硫氰酸荧光黄，可直接将其标记在特异性抗体上，也可标记在第二抗体上。

酶标法

将过氧化物酶和抗体（或能与抗体发生特异性结合物质）结合起来，然后由结合物中的抗体（或其他物质）直接或间接地与组织和细胞的相应抗原发生特异性结合，形成不溶性免疫复合物，再通过适当的底物显色以证实抗原是否存在及其分布位置。由于组织和细胞内可能存在内源性过氧化物酶，因此在进行反应前应设法先将内源性过氧化物酶封闭。

胶体金法

标记物为粒子直径不一的胶体金，可根据不同用途加以选择。胶体金除可标记在第二抗体上外，还可标记IgG和SPA。SPA由于能与IgG分子的Fc段特异性结合而又不影响Fab段的免疫活性，故常被用来代替第二抗体，且不受种族限制。可用于光镜，也可用于电镜，且可用来作双标记或与其他方法组合进行多重染色。

免疫铁蛋白法

标记物为铁蛋白，用以检测表面抗原，也可用免疫铁蛋白法对细胞内抗原进行定位，染色方法可用直接法和间接法，也可用铁蛋白-抗铁蛋白抗体复合物法。

放射性同位素产生的射线（主要为β射线）作用于感光乳胶层中的卤化银晶体可使其形成潜影，再经显影处理，卤化银晶体则被还原为黑色颗粒。放射自显影术即利用此种原理，将放射性同位素或放射性同位素标记的物质处理组织切片，再使其在感光乳胶上曝光和显影，然后根据组织和细胞中黑色银粒的数量，判断组织和细胞，是否已与标记物质发生反应，反应的部位以及强弱程度。