在厌气条件下，某些细菌将或代替O₂作最终电子受体，使其还原成N₂或N₂O的过程。又称反硝化作用或脱氮作用。在农田土壤中能造成氮肥的损失，其量为施入氮肥的25～30%，最高可达70%。另一方面，硝酸盐还原能解除土壤和水域中因硝酸盐过量而造成的隐患。但此作用的中间产物NO和N₂O也可造成大气污染。

具有反硝化能力的微生物在自然界中普遍存在，已报道有70多属，尚未发现细菌以外的生命形式能进行反硝化作用。土壤中反硝化细菌构成微生物区系的重要组分，假单胞菌属中能进行反硝化作用的种比任何其他属多，其中荧光假单胞菌（Pseudomonas fluores-cens）数量最大。地衣芽孢杆菌（Bacillus lichenifor-mis）反硝化的作用最强，而研究最多的脱氮假单胞菌（Ps.denitrificans）和脱氮副球菌（Paracoccus denitri-ficans）却不是土壤中脱氮优势菌。

反硝化作用是氮氧化物逐步还原的过程，如下式：

硝酸还原

不同的菌用作最终电子受体的氮氧化物不同，作用的最终产物也不一样。如产碱杆菌的一些种只从开始还原，而假单胞菌的某些种的终产物不是N₂而是N₂O。在淹水条件下，硝酸盐还原的终产物可为。

反硝化细菌在好气条件下用O₂作最终电子受体与厌气条件下用氮氧化物作最终电子受体的呼吸作用是一个相似的过程。用于有O₂呼吸的电子传递链也用于硝酸盐还原，参与催化或还原的酶称异化硝酸盐还原酶（DNR）或硝酸还原酶A。这些酶的合成和活性均受O₂和底物的调控。O₂能终止还原。

绝大部分反硝化菌是化能异养菌，以有机碳化物作电子供体；脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）为化能自养菌，以还原型的硫化物作电子供体；副球菌是兼性自养，以H₂作电子供体；生丝微菌（Hypho-microbium）则生长在C₁化合物上，并以C₁化合物作电子供体。所以反硝化作用强度与土壤有机质的含量或相应底物含量有密切关系，O₂和有机质是调控硝酸盐还原的关键因素。

反硝化过程产生的N₂O有破坏O₃层的可能性。当N₂O上升至同温层，则N₂O＋O→2NO，NO＋O₃→NO₂＋O₂，导致O₃水平降低，影响O₃层吸收太阳辐射输入的紫外线。