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诱变育种

利用物理或化学手段诱发产生遗传变异以选育新品种的技术。诱变的手段有:电离射线、各种化学诱变物质、超声波、激光、微波及“极端温度”等处理。在实践中应用广泛、效果显著的是辐射育种及化学诱变育种。自从穆勒(H.J.Muller,1927)用X射线诱发果蝇突变以来,辐射育种逐渐受到重视。至1988年世界上用辐射引变育成的作物品种已达600余个。

利用物理或化学手段诱发产生遗传变异以选育新品种的技术。诱变的手段有:电离射线、各种化学诱变物质、超声波、激光、微波及“极端温度”等处理。在实践中应用广泛、效果显著的是辐射育种及化学诱变育种。

自从穆勒(H.J.Muller,1927)用X射线诱发果蝇突变以来,辐射育种逐渐受到重视。至1988年世界上用辐射引变育成的作物品种已达600余个。20世纪60年代初期,化学诱变处理正式用于蔬菜育种,如马铃薯、番茄、豌豆、豇豆、黄瓜等已广泛应用,并获得了一些有价值的突变体。中国60年代广泛开展诱变育种,已先后育成大白菜、萝卜、甜瓜和加工用黄瓜等的新品种,以及丰产、抗病、加工性能好的番茄品系。

诱变育种的特点

有如下四个特点:①增加突变率,扩大变异谱。通常自然突变频率极低,而人工诱变可使突变率成千倍增加,变异谱也显著扩大。杂交是原有基因的重组,而诱变可导致全新类型的产生,丰富作物的基因库,从而扩大选择范围。②在正确选择亲本和诱变处理剂量等条件下,诱变常有产生“点突变”的特点,使品种改善某一性状而不损害或改变其他优良性状。③诱发染色体结构变异。诱变处理可造成染色体的断裂,打破某些优良性状和不良性状的紧密连锁。或利用染色体结构变异创造某些新类型。④定向诱发有利变异的机率较低。由于诱变因素和不同作物的内在因素以及外界因素三者之间的动态关系极为复杂,目前尚难于做到人工定向控制突变过程,从而限制了发挥诱变育种的优点。

诱变育种的机制

因诱变方法不同而异。辐射诱变一般要经过三个阶段:①物理作用阶段。生物有机体体内的分子“电离”或“激发”。②化学反应阶段。“电离”或“激发”的分子产生“离子对”及“自由基”,引起复杂的化学反应,导致新的化学成分的产生。③生物学作用阶段。新的化学反应产生的异常物质,刺激或打乱了生物体正常的代谢过程,当这种反应影响到染色体或核内、核外的核酸分子结构时,便可诱发可遗传的突变。化学诱变剂的作用是靠其化学特性直接与遗传物质发生生化反应而产生遗传突变的。辐射处理往往能够获得广泛的染色体结构突变谱,而化学药剂则更多的引起基因点突变。

诱变方法

任何诱变育种都需经过诱发变异和选择有利变异两个阶段。

辐射种目前经常采用的射线源主要有γ射线、X射线和中子射线等P此外,紫外线多用于微生物育种,α射线可用于细胞内部照射,β射线可用于花粉、孢子照射及植物的内照射。处理方法有:①外照射。普遍应用放射性钴(60Co),操作也方便。可以在照射室或特设的钴植物园中进行。按处理的器官或部位,又分为种子照射、花粉照射、子房照射、营养器官照射及植株照射等。②内照射。是将一定“比强”的放射性同位素引入植物体内,使其所放出的射线进行体内照射。具体方法有浸种法、施入法、注射法、涂抹法等。常用的放射性同位素主要有32P、35S、45Ca等(放出β射线),60Co、65Zn、59Fe等(放出γ射线)。③间接照射。也称为培养基或培养液照射。先用射线照射纯水、培养液或培养基,然后将萌发的种子或其他组织放入其中处理。也可先照射种子或其他组织,在低温下提取其浸出液,再以此处理未经照射的种子或组织。组织培养及细胞培养迅速发展,为间接照射在植物育种中的应用开辟了广阔的前景。

化学诱变早年常用芥子气,现在新的诱变剂不断被发现和应用,常用的有:①烷化剂类。如次乙亚胺(简称E.I.)、环氧乙烷、乙基磺酸甲酯(EMS)、乙基磺酸乙酯(EES)、甲基磺酸甲酯(MMS)、丙基磺酸丙酯(PPS)、甲基磺酸丙酯(PMS)、甲基磺酸丁酯(BMS)、硫酸二乙酯(DES)、硫酸二甲酯(DMS)、硫酸甲乙酯(MES)等。②核酸碱基类似物。如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-溴去氧尿嘧啶核苷(5-BUdR)、8-氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、咖啡碱、马来酰肼及“福码诱变剂”如吖啶类物质等。③简单的无机化合物。如MnCl2、CuSO4、H2O2、LiCl、NH3等,诱变效果较差。经研究发现某些脱氨剂是有效的诱变素,尤其亚硝酸是自然突变的主要诱因。④简单的有机化合物。如醋酸、甲醛、氧化乙烯、乳酸、重氮甲烷、氨基甲酸乙酯等。⑤抗生素类。如丝裂霉素C、重氮丝氨酸、链霉黑素等。⑥异种DNA、高级酚、羟胺、苯的衍生物、嘌呤及其衍生物、磺胺药物以及各种麻醉药剂等复杂的有机化合物。处理的方法是将上述药剂配成适当浓度的溶液,并保持一定的pH值,用以处理植物材料(种子、花序、花粉、合子、接穗、插条、块茎、鳞茎或整个植株)。处理方法有浸渍法、涂抹法、滴液法、注入法、熏蒸法以及施入培养基(液)培养法等。使用的剂量和处理时间因植物种类、器官以及所用药剂种类不同而异。

由于辐射或化学处理都难于诱发定向变异,为了提高育种的效果,一般应注意:①选用除需改良的目标性状外其他性状均属优良的材料作亲本;同时避免亲本材料的单一性,以利用不同品种或类型丰富的遗传变异基础和对诱变因素的不同敏感性和反应;②按不同剂量分别播种诱变处理的种子(一般用R1或M1表示)。由于突变多属隐性,因此在不必进行选择淘汰,而将存活株全部自交,分穗分果采收种子,分别播成一个小区,称为“穗系区”;③隐性突变经一代自交至R2(M2)代便可显现出来,故对R2(M2)的每一个植株都要仔细观察鉴定,标出全部有变异性状的植株并按株系分别播种,称为“株系区”,以进一步分离和鉴定突变;④以营养器官作诱变对象者,由于同一器官的不同芽对诱变因素的敏感性及反应不一样,需将其分别编号,分别繁殖,进行观察鉴定。如发现有利变异,便可用无性繁殖加以固定,进而选育成新品种。

离体培养中突变体的筛选

在离体培养条件下,自发突变频率常显著提高,如细胞悬浮培养的突变频率约为10-6~10-7,单倍体、原生质体培养约为10-4~10-5。因此植物组织培养本身,就可能提供各种突变,从中筛选出具有不同遗传型和表现型的植株。自发突变的频率常受外植体的遗传基础、培养基的成分和培养条件以及培养时间长短等因素影响。为使突变频率进一步增加,也可在离体培养中结合采用物理或化学诱变处理,进行人工诱发突变。

离体培养所产生的主要突变类型有:①抗药性突变。可抵抗特殊的药剂(如除草剂、抗菌素等)或代谢拮抗物等。②抗逆境突变。如抗盐碱、抗某些金属离子、抗旱、抗寒等异常的环境。③抗病性突变。可抵抗某种病害。

建立有效的鉴定分离筛选体系,是细胞突变体研究和利用的核心。常用的主要分离筛选方法有:①正选择法。常用于抗性突变体的筛选。将供体细胞置于只有突变体才能生长的、含有特定物质的培养基上,以此淘汰不能生长的正常细胞。②负选择法。在某些培养基中被选择的突变体细胞不能生长,而正常的“野生型”细胞则能旺盛生长。再用适当的药物如5-溴去氧尿嘧啶、氮鸟嘌呤等进行处理,使正常细胞死亡,突变体保留下来。③定位选择法。在某些抗病性细胞筛选时,植株经诱变后接种病原体,使充分发病后,选择切取未发病的“绿岛”部位的细胞,进行离体培养,从中有可能筛选出抗病突变体。不论采用何种筛选法,最后都必须使细胞突变体再分化成植株,以进一步检验选择的可靠性。对于某些由多基因控制的性状,常缺乏专一有效的细胞筛选方法,因而只有把培养物再分化成植株,然后在植株整体水平上进行筛选。